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LA PCR的原理

LA PCR的关键是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。在PCR过程中当有错误的碱基摄入时，反应性能将大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可将错配的碱基除去，从而延伸反应能顺利地进行下去，使长链DNA的扩增成为可能。

原位PCR( in situ PCR)技术

原位PCR综合了PCR和原位杂交( Insitu hybridization, ISH)的优点是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增.再用特异性的探针原位杂交检测。原位PCR标本一般需先经化学固定,以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内。在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织，不易透过细胞膜向外弥散，故保留在原位。这样就很容易应用ISH将其检出,同时还可对目的DNA序列的组织细胞进行形态学分析。

 PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA部分片段,细胞内DNA复1制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。

[PCR步骤]标准的PCR过程分为三步:

1.DNA变性(90°C-96*C): 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火(25C-65'C): 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5'端→3'端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的时间内copy完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°C -65C间进行，以减少一次升降温过程，提

高了反应速度。